无标记显微成像突破，实现白细胞精准分类

白细胞数目异常可用于判断免疫系统功能失常或病毒感染，例如嗜中性粒细胞与淋巴细胞之比的急剧增加是SARS-CoV-2感染的表征之一。基于电阻抗和光散射的无标记的白细胞计数仪只能简单的区分相当基础的类别。对于更加细致的白细胞类别, 目前只能通过抗体荧光标记来区分。然而抗体荧光标记方法也存在其自身的局限: 首先, 只基于标记部分进行分类判断, 整体形态信息遗失；其次， 如果要同时分类多种细胞，就需要多种试剂与多荧光通道；最后，标记过的细胞不适合用于后续分析与测试。

定量相位显微技术（Quantitative Phase Microscopy: QPM）是一种适用于无标记标本高速成像的方法。QPM通过二维测量光程差图谱，可精确勾画出样本不同区域的密度和厚度分布，对于透明结构（例如活细胞）具有很高的成像对比度。通过使用深度神经网络对于白细胞的定量相位图进行信息挖掘，研究团队开发了一种深度神经网络可对白细胞的定量相位图进行信息挖掘，实现了对于多种白细胞亚型的分类，结果优于现有的无标记白细胞分类方法。

（1）智能无标记血液分析系统

图 1 智能无标记血液分析系统

（2）白细胞分类方法

数据集一共包括六类白细胞亚型，分别为单核细胞（Monocyte），粒细胞（Granulocyte），B淋巴细胞（B lymphocyte），T淋巴细胞（T lymphocyte）， CD4细胞和CD 8细胞。其中，B淋巴细胞和T淋巴细胞都是淋巴细胞的亚型，CD4细胞和CD8细胞是T淋巴细胞的亚型。

图2 各白细胞亚型定量相位显微图及面积，干重分布

对于单核细胞，粒细胞，B淋巴细胞以及T淋巴细胞的分类，基于以上四类细胞的从属关系以及相似程度，研究人员设计了一个级联ResNet网络（如图3所示）。级联结构中的第一个ResNet，会将输入细胞判定为单核细胞，粒细胞以及淋巴细胞之一，如果判定结果为淋巴细胞，那么会将该细胞再次输入到第二个ResNet中，进一步将其细分成B淋巴细胞或者T淋巴细胞。对于CD4 T细胞和CD8 T细胞，研究人员使用了一个单独网络对于这两者进行区分。

图3 白细胞分类网络架构

（1）分类准确性

研究者首先在随机生成的测试集上测试了系统的分类性能。如图4（a），级联ResNet对于单核细胞，粒细胞，B淋巴细胞和T淋巴细胞的分类准确率参数F1-score分别为94.0％，95.4％，88.2％以及84.6%。图4（b）和（c）分别为级联结构中两个ResNet的precision-recall curve。图4（d）和（e）中， t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) 方法被用来对于ResNet输出的特征向量进行降维并分类别绘制于同一个三维空间中。可以看到，不同类别之间界限较为清晰，说明网络提取的特征具有较高的有效性。对于CD4 T和CD8 T细胞间的区分，F1-score分别为80.4%和77.5%，图4（f）-（h）显示了相关的结果。

图4 随机验证实验结果

（2）交叉验证

实际医学应用中，血液样本通常来自于陌生人，而不同人的血液形态特征会有一定差异。对于本实验中的6位血液捐献者，每个人的各类白细胞面积与干重分布被绘制出来并进行了比较，验证了差异的存在（如图5（a）（b）所示）。为了探索人与人之间的差异对于分类准确性的影响，研究者进行了交叉验证实验，也就是使用其中五个人的数据去训练网络，然后再在剩下一个人的数据上进行测试，交叉进行六次。实验结果如图5（c），黑线对应准确率为随机验证实验中的准确率减10%。对于单核细胞和粒细胞，不存在在交叉验证中准确率下降10%以上的情况；对于B淋巴细胞，总共三次实验，其中一次准确率下降超过10%；对于T 淋巴细胞，五次实验中的一次准确率下降超过10%。对于B淋巴细胞和T淋巴细胞，所有实验平均F1-score分别为84.1%和85.9%，优于过往基于明暗场图像的结果。

图5 交叉验证实验

这项概念验证性研究证明了定量相位显微技术采集的无标记图像与深度神经网络相结合可对人类白细胞亚群进行分类。得益于设计良好的神经网络模型，信息丰富的定量相位图像以及大量数据，该智能无标记血液分析系统对粒细胞，单核细胞，B淋巴细胞和T淋巴细胞的分类能力优于现有的其它无标记方法，对于CD4 T细胞和CD8 T细胞也有一定的区分能力。研究结果还表明，该智能无标记血液分析系统的检测准确性一定程度上可以不受人与人间差异的影响，具有应用于临床的潜力。香港中文大学团队近期实现了定量相位显微系统的小型化与智能化，有望将基于该系统的血液分析技术进行更大范围的推广，未来可造福于普通大众。

麻省理工学院人工智能实验室金帝博士，湖南大学信息科学与工程学院曾湘祥教授，以及香港中文大学生物医学工程学系汤启宇教授也参与了这项研究。