正如我们在上一期提到的那样，传统的光片是由高斯光束通过一个柱形透镜来实现的。最初，只用一个照明物镜和一个成像物镜(图1)，称为L-SPIM。这种光片最大的问题是照明不均匀，光强会沿着传播方向逐渐减弱。为了解决这个问题，有效视野只能选择相对均匀的照明范围，因此样品必须做至少四次90°旋转 (图1)，成像速度很慢，而且还要再使用复杂的算法进行后处理，很容易产生伪迹。

图1 L-SPIM：需要旋转至少四次才能完整成像

为了解决这个问题，科学家们做出了改进，使用两个相对的物镜进行双边照明，称为T-SPIM（图2）。T-SPIM扩大了有效视野，增加了成像速度。但深部的样品信号由于色散和散射特性，成像效果还是比较差。为了保证图像质量，仍需要将样品旋转180°。

图2 T-SPIM双向照明：旋转180°就能完整成像

或者使用两个成像物镜同时进行双边成像（mSPIM，图3)。通过旋转样品，将多角度的图像进行融合，可以得到在xyz方向上一致的分辨率，z轴分辨率可以提高3倍。

图3 mSPIM。双边照明和双边成像：对样品在0°和90°分别成像，融合之后产生各向相同的分辨率

目前市面上各种各样的T-SPIM主要是在光片数和位置上有所不同，目的都是为了获得更加清晰准确的图像。如何将两个光片进行完美的匹配是这种方法主要的技术难点。

早期的光片显微成像中还存在伪影问题(图4A, C)。这是指由于样品中含有光密度较高的结构如色素等阻挡了激发光，或包含具有微透镜特性的物质（如脂质）造成光的散射和照明不均匀而产生的一些暗线。解决这个问题的一种方法，是小角度高速旋转照明光片(图4B, D)，使得部分在某个照明角度下的阴影，在另一个照明角度下显现出来。

图4 图像伪影。A)斑马鱼胚胎受精后32小时光片成像。B) 光片旋转后A中样品成像。C)色素或更大的荧光结构挡住了照明光。D)光片旋转后改善了这种情况。(Huisken & Stainier, 2009)

另外一个解决办法是将组织透明化（图5）。一个多世纪以来，研究者们不断开发出各种有机和无机溶剂，将更大的样品透明化，从而能够更深入更详细地研究样品结构。

图5 组织透明化（CLARITY法）。A)小鼠大脑透明化前B)透明化后（Chung et al.，2013）

另外，样品的固定也是光片显微镜的一大难题。要进行活体成像，样品必须固定在光学透明的培养基中，才不会影响成像，并且样品要方便进行旋转。从单个细胞到整个器官，样品固定方法五花八门，取决于研究人员的创造力和具体样品的需求 (图6A-D)，这里我们就不进行详细讨论了。

图6 样品安装示例。A)固定在琼脂糖内的斑马鱼胚胎。B)挂钩固定的组织/器官。C)聚四氟乙烯管中的细胞球。D)附着在玻片上的细胞。（Reynaud et al. , 2015）

高斯光束扫描光片

现在我们使用的大部分光片系统都不使用柱形透镜，而是通过激发光扫描得到的“虚拟”光片(图7)，称为DLSM（Digital scanned light sheet microscopy）。和静止光片相比，扫描光片照明更加均匀。由于扫描速度很快，需要比静止光片更高的峰值激发功率（但和传统宽场显微镜以及共聚焦相比，仍然要小得多)。

图7 基于高斯光束扫描的L-SPIM光片

扫描光片和使用卷帘快门（rolling shutter）的sCMOS相机可以形成完美的配合。通过相机和扫描光束之间的同步，实现只有当前读取的行被激发光照射，杜绝了非成像区域的干扰信号，提高图像对比度和分辨率。Teledyne Photometrics sCMOS 相机内置的 Programmable Scan Mode （图8）就是专门为此而设计的（详情可阅读最下方阅读原文链接）。

图8 Programmable Scan Mode：同步相机曝光和扫描光片激发光

贝塞尔光束扫描光片

正如我们在上一期最后讲到的，高斯光束产生的光片厚度和长度之间是相互制约的，无法满足细胞水平以下的分辨率要求，因此不断追求极限的科学家们又将目光投向了贝塞尔光束 (图9)。贝塞尔光束理论上是非衍射光束，与高斯光束相比，它的截面直径小得多，一般< 1 µm，传播时截面轮廓和光强都保持不变；同时它还具有自愈特性，经过散射组织后，光束形状的失真很小。虽然事实上我们无法得到真正理想的贝塞尔光束，但是通过使用轴对称衍射光栅来聚焦高斯光束，或在远场中放置窄环形光圈，我们可以得到近似的贝塞尔-高斯光束，在一定的距离内几乎没有衍射。

2011和2012年，诺贝尔奖获得者 Eric Betzig 教授研究组的 Planchon 和高亮等首先尝试用贝塞尔光束扫描来产生光片（图10）。光片的尺寸在整个长度上不会发生显著变化，从而进一步提高了有效视野和分辨率。

图9 A)高斯光束B)贝塞尔光束。Power & Huisken (2017)

图10 基于贝塞尔光束扫描的L-SPIM光片

晶格光片

贝塞尔光束光片也存在一个问题，即当截面越小，也就是光片越薄的时候，旁瓣的能量也会越高，这样就会导致非焦平面的样品被激发，降低了分辨率，增大了光毒性。2014年，Eric Betzig研究组的陈壁彰、王凯等人又在Science杂志上发表了晶格光片显微镜（Lattice Light-Sheet Microscopy）技术。通过使用空间光调制器（SLM），让照明物镜发出的激发光形成并行排列的多束贝塞尔光束(图11)，同时实现光束的倍增和激发。这种方法有几个显著的优势：

与结构光照明（SIM）相结合，显著降低旁瓣能量的同时维持较薄的光片厚度，进一步提高图像空间分辨率
能够在极低的峰值激发功率下快速成像，光毒性更小
同时照亮整片样品，增加了有效视野，大大加快了成像速度（可达200fps）

图11 并行贝塞尔光束

配合大视野的高速sCMOS相机（如Teledyne Photometrics 公司的Prime BSI，Iris15等），Lattice Light-Sheet 非常适用于对活细胞进行4D成像。高速，高分辨率，低光毒性，意味着我们可以在更长的时间内记录细胞内的生理活动。

除了晶格光片显微镜之外，光片显微镜家族还有许多其他的兄弟姐妹，我们将在下一期中继续为大家介绍，请持续追番~

References

Chen,B.C. et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos athigh spatiotemporal resolution. Science346, 1257998 (2014).

Chung, K., Wallace et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. May 16;497(7449):332-7 (2013)

Fahrbach FO, Voigt FF, Schmid B, Helmchen F, and Huisken J, Rapid 3D light-sheet microscopy with a tuneable lens. Optics ExpressVol. 21(18): 21010-21026 (2013)

Huisken, J. & Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development.Jun;136(12):1963-75 (2009)

Planchon,T.A. et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Naturemethods 8, 417-423 (2011).

Power, R. M. & Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. Mar 31;14(4):360-73 (2017)

Reynaud EG, Peychl J et al. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. Jan;12(1):30-4 (2015)

Voie A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal- plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. Jun;170(Pt 3):229-36 (1993)

*文章来源于Teledyne Photometrics，作者Photometrics

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