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前沿显微成像技术专题之：光片荧光显微镜(3)发表时间：2021-11-12 16:28
备受大家关注的光片荧光显微镜专题终于迎来最后一期啦！通过前面第一，第二期的介绍，相信大家对光片显微镜已经有了较为全面的了解。在本期中，我们将介绍另外几种光片显微技术，它们和第二期最后介绍的晶格光片显微镜一样，都是对传统光片显微技术的改进，以满足更高的成像要求。最后，我们将为大家总结如何挑选适合光片显微镜的科学相机。 倒置平面照明显微镜 (d)iSPIM  图1 diSPIM：两个物镜轮流进行照明和成像 (d)iSPIM可以安装在任何的倒置显微镜上。采集速度可以达到200fps，信噪比和转盘共聚焦显微镜差不多，特别适用于活体3D成像。与大多数其它光片显微镜需要将样品嵌入凝胶中并悬浮在物镜之间相比， (d)iSPIM的样品制备相对比较简单，而且方便固定。通过更换介质，可以在长时间内对活体样品成像。 倾斜平面照明显微镜 oSPIM 为了解决这个问题，倾斜平面照明显微镜(Oblique Single Plane Illumination Microscopy，oSPIM）应运而生。oSPIM 将照明物镜置于样品下方，以30°倾斜角生成光片。高NA值的成像物镜位于样品上方，与照明物镜成60°角，垂直于光片（图2）。这样就可以避免物镜发生碰撞，为使用高倍物镜创造了条件。另一方面，可以放置35mm以上的培养皿，为细胞和组织培养样品提供了理想的平台。 oSPIM 将光片显微镜低光漂白和光损伤的优势与高分辨率高放大倍率结合起来，可用于长时间细胞和亚细胞水平成像。同时，照明物镜也可用于常规荧光成像，如宽场、共聚焦或TIRF。这样一来，oSPIM系统可以将高分辨率荧光显微镜与高分辨率光片显微镜结合在一起，提高了系统的灵活性。  图2 倾斜平面照明显微镜 （oSPIM） 另外还有一种采用倾斜光片方法的光片显微镜——TILT Light-sheet microscopy。 它是由北卡罗来纳大学的 Paul Maddox 研究组率先开发的，现在已经由Mizar公司制造和销售。TILT 不需要照明物镜，而是利用一种称为横向干涉倾斜激励（LITE）的技术，将校准后的激发光束依次通过光罩（Photomask）和柱形透镜，聚焦成近似矩形棱镜形状的光束。然后将光片倾斜，通过这种方式，照明光片可以在非常接近成像物镜处生成（图3，下）使TILT光片系统也能够使用高倍物镜（60x，1.49）成像。  图3 传统光片照明（上）vs TILT（下） TILT 使用的样品可以固定在玻片上，不需要特殊制备的样品，也不需要进行复杂的反卷积后处理。它可以安装在大多数正置或倒置显微镜上，还可以与微分干涉（DIC）或其他显微技术相结合使用，因此和 oSPIM 一样具有很高的灵活性。 拼接光片显微镜（Tiling-light sheet Microscopy）  图4 拼接光片（Tiling-light sheet）(L Gao, 2015) Tiling-light sheet 可根据样品及具体成像要求，对光片的厚度和拼接数量进行灵活的调整。再结合贝塞尔光束，可以快速地对大样品进行高分辨率3D成像。 光片显微镜相机选择建议 但是，小像元相机灵敏度相对较低，而大像元相机灵敏度更高，可以缩短曝光时间，提高成像速度。因此，相机选择要根据具体的应用和不同的光片技术综合考虑。例如，我们在前文中提到的 diSPIM，oSPIM 和 TILT 等通常使用高倍物镜（40x，60x等），我们建议使用像元更大的相机，如背照式 sCMOS Prime BSI（6.5 μm 像元），Prime 95B（11 μm 像元）。它们不仅能够提供与高倍物镜相匹配的分辨率，灵敏度也大大提升。允许减少曝光时间或降低激发光强度，进一步降低光漂白和光毒性，从而可以在更长的时间尺度上对活细胞进行成像。  图5 Prime 95B 在 TILT 光片显微镜下拍摄的表达 LifeAct-mCherry 的裂变酵母菌（150x , 1.49NA）。Prime 95B 满阱容量高达80000e-，读出噪声低至1.6e-，具有真实 16bit 动态范围，提高成像对比度。(From Paul Maddox)  除此之外，光片显微镜常常会用红外和近红外激发光对大样品进行深部成像，因此相机在这个近红外波段的量子效率也很重要。这时，背照式相机就有很大优势。 OpenSPIM 平台 References Abhishek, K., Wu, Y., Christensen, R., Chandris, P., Gandler, W., McCreedy, E., Bokinsky, A., Colon-Ramos, D. A., Bao, Z., McAuliffe, M., Rondeau, G. & Shroff, H. (2014) Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat Protoc. Nov; 9(11): 2555-2573; doi: 10.1038/nprot.2014.172 Fadero, T. C., Gerbich, T. M., Rana, K., Suzuki, A., DiSalvo, M, Schaefer, K. N., Heppert, J. K., Boothby, T. C., Goldstein, B., Peifer, M., Allbritton, N. L., Gladfelter, A. S., Maddox, A. S. & Maddox, P. S. (2017) LITE microscopy: a technique for high numerical aperture, low photobleaching fluorescence imaging. Preprint. https://doi.org/10.1101/181644 Liang Gao, Tiling light sheet selective plane illumination microscopy using discontinuous light sheets. bioRxiv (2018) 378232. Peter G Pitrone, Johannes Schindelin, Luke Stuyvenberg, Stephan Preibisch, Michael Weber,Kevin W Eliceiri, Jan Huisken & Pavel Tomancak. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods 10, 598–599 (2013) doi:10.1038/nmeth.2507 *文章来源于Teledyne Photometrics，作者Photometrics
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